Mikroskopia Nosema/Vairimorpha

Procedura wykrywania i ilościowego oznaczania spor Nosema/Vairimorpha w rodzinie pszczelej.

Tutorial wideo

Materiały

• Mikroskop optyczny z wbudowaną kamerą. Wymagana specyfikacja:

  • Układ optyczny: soczewki ze szkła optycznego
  • Powiększenie całkowite: 400× (obiektyw: 40×; okular: WF10×)
  • Stolik mechaniczny: lewo–prawo / przód–tył
  • Minimalna rozdzielczość kamery: 0,3 MP

  Przykładowe mikroskopy spełniające wymagania:

  • AmScope M150 Series z kamerą USB
  • Levenhuk Rainbow D2L 0.3M

• Pęseta

• Moździerz z tłuczkiem (lub inne narzędzie do homogenizacji)
• Hemocytometr (preferowany) lub standardowe szkiełka mikroskopowe
• Szkiełka nakrywkowe
• Woda dejonizowana (preferowana) lub woda kranowa
• Mikropipety z jednorazowymi końcówkami

Przygotowanie próbki

1. Pobierz próbkę pszczół

Użyj jednej z poniższych opcji:

• Martwe pszczoły: zbierz 25 martwych pszczół robotnic z wkładki higienicznej dna ula, pod warunkiem że pszczoły są martwe (bez oznak rozkładu czy porastania pleśnią).
• Żywe pszczoły: złap 25 żywych pszczół robotnic przy wylotku ula.

Przechowywanie przed badaniem

Jeśli nie możesz od razu wykonać badania ani wysłać próbki do laboratorium, zamrażanie pszczół jest dopuszczalne wyłącznie w przypadku badań na Nosemę:

• Każda zamrożona próbka musi być czytelnie i jednoznacznie opisana, tak aby można było ustalić, z którego ula pochodzi.
• Temperatura przechowywania: co najmniej −8 °C.
• Próbki można przechowywać w zamrażarce przez około 3–5 miesięcy przed badaniem.
• Próbek nie wolno rozmrażać i zamrażać ponownie.

2. Homogenizacja

1. Dodaj 25 mL wody dejonizowanej do próbki pszczół (1 mL na pszczołę).
2. Zmiażdż (zhomogenizuj) całe pszczoły dokładnie, aby uzyskać jednolitą zawiesinę.
3. Wymieszaj zawiesinę dokładnie — spory mają tendencję do osadzania się na dnie.

Dlaczego homogenizujemy całe pszczoły?

Spory Nosema są obecne nie tylko w przewodzie pokarmowym, ale również w gruczołach gardzielowych i nasieniu trutni. Homogenizacja całych pszczół robotnic zapewnia kompleksowe wykrycie.

Przygotowanie preparatu mikroskopowego

1. Mikropipetą nanieś małą kroplę (~40 µL) dobrze wymieszanej zawiesiny na czyste szkiełko.
2. Przykryj szkiełkiem nakrywkowym.

Użyj hemocytometru, jeśli masz dostępny

Jeśli masz hemocytometr, użyj go — liczenie jest łatwiejsze i bardziej zestandaryzowane.

Liczenie spor

1. Ustaw ostrość mikroskopu na powiększeniu 400× za pomocą śruby mikrometrycznej.
2. Wybierz pięć losowych pól widzenia (pięć dużych kwadratów siatki, jeśli używasz hemocytometru).
3. Jeśli pole zawiera nadmiar zanieczyszczeń, wybierz losowo inne.

4. W każdym polu widzenia szukaj spor Nosema.

   Spory Nosema spp. są owalne z ciemnym, dobrze zarysowanym brzegiem (Rys. 1). Uważaj, aby nie pomylić ich z ziarnami pyłku, które są większe i idealnie okrągłe.

   
   Rys. 1 Obraz mikroskopowy (400×) spor Nosema spp.

5. Policz spory w każdym polu widzenia i zapisz wartości.

6. Zrób zdjęcie każdego z pięciu pól widzenia, aby przesłać je do aplikacji Apisense.
7. Oblicz średnią liczbę spor z pięciu pól widzenia — przyda się do oceny wyniku. Do aplikacji wpisujesz liczby z poszczególnych pól, nie średnią (patrz Raportowanie w aplikacji Apisense).

Przykład — Tabela 1

Liczba spor Nosema zaobserwowanych w pięciu polach widzenia dla każdej próbki.

Próbka	Pole 1	Pole 2	Pole 3	Pole 4	Pole 5	Średnia
1	40	38	52	44	50	44,8
2	…	…	…	…	…	…

Raportowanie w aplikacji Apisense

Wynik zapisujesz w tym ulu, z którego pochodzi próbka.

1. Otwórz Szczegóły ula: zakładka Pasieki → kafelek pasieki → kafelek ula.
2. W dolnym menu wybierz Dodaj..., a następnie Badanie.

3. W widoku Dodaj badanie uzupełnij:

   • Data badania — dzień wykonania badania mikroskopowego.
   • Rodzaj badania — wybierz z listy rozwijanej Mikroskop.
   • Zdjęcia i liczby spor — dodaj 5 zdjęć, po jednym z każdego pola widzenia. Pod każdym zdjęciem znajduje się osobne pole Liczba spor Nosema (1), (2), … (5) — wpisz w nim liczbę spor policzoną w tym właśnie polu widzenia.

4. Zapisz badanie przyciskiem potwierdzenia (ikona ✓) na dole ekranu.

Wpisujesz wyniki z poszczególnych pól, a nie średnią

Aplikacja przyjmuje pięć osobnych liczb — po jednej do każdego zdjęcia. Nie wpisuj do niej średniej z Tabeli 1; średnia służy Twojej własnej ocenie wyniku, a do aplikacji trafiają liczby cząstkowe.

Komplet jest wymagany: bez pięciu zdjęć i pięciu liczb aplikacja nie zapisze badania — pokaże komunikat Brakuje N z 5 zdjęć albo oznaczy niewypełnione pole liczbowe.

Zapisane badanie znajdziesz w zakładce Badania w szczegółach ula. Możesz je stamtąd otworzyć, edytować lub usunąć.

Funkcja pilotażowa

Zakładka Badania oraz opcja Badanie w menu Dodaj... są dostępne wyłącznie dla kont objętych pilotażem. Pełny opis widoku: Dodawanie badania.

Bibliografia

1. Bartolomé C, Higes M, Hernández RM, Chen YP, Evans JD, Huang Q. The recent revision of the genera Nosema and Vairimorpha (Microsporidia: Nosematidae) was flawed and misleads the bee scientific community. J Invertebr Pathol. 2024;206: 108146. doi:10.1016/j.jip.2024.108146
2. Fries I, Chauzat M-P, Chen Y-P, Doublet V, Genersch E, Gisder S, et al. Standard methods for Nosema research. J Apic Res. 2013;52: 1–28. doi:10.3896/IBRA.1.52.1.14
3. Nosemosis of honey bees, WOAH Terrestrial Manual. 2024. WOAH (PDF)
4. Mazur ED, Gajda AM. Nosemosis in Honeybees: A Review Guide on Biology and Diagnostic Methods. Applied Sciences. 2022;12: 5890. doi:10.3390/app12125890