Nosema/Vairimorpha mikroskopisi

Bal arısı kolonisinde Nosema/Vairimorpha sporlarını bulma ve sayma prosedürü.

Eğitim videosu

Malzemeler

• Dahili kameralı ışık mikroskobu. Gerekli özellikler:

  • Optik sistem: optik cam mercekler
  • Toplam büyütme: 400× (objektif: 40×; oküler: WF10×)
  • Mekanik tabla: sağa-sola / ileri-geri
  • En düşük kamera çözünürlüğü: 0,3 MP

  Bu gereksinimleri karşılayan mikroskop örnekleri:

  • AmScope M150 Series with USB camera
  • Levenhuk Rainbow D2L 0.3M

• Pens

• Havan ve havaneli (veya başka bir homojenizasyon aracı)
• Hemositometre (tercihen) veya standart mikroskop lamı
• Lamel
• Deiyonize su (tercihen) veya musluk suyu
• Tek kullanımlık uçlu mikropipetler

Numunenin hazırlanması

1. Arı numunesini toplayın

Aşağıdakilerden birini kullanın:

• Ölü arılar: kovanın hijyenik taban tahtasından 25 ölü işçi arı toplayın. Arılarda çürüme veya küf belirtisi olmamalıdır.
• Canlı arılar: kovanın uçuş deliğinde yakalanan 25 canlı işçi arı toplayın.

Muayeneden önce saklama

Muayeneyi yapamıyor veya numuneyi hemen gönderemiyorsanız, arıların dondurulması yalnızca Nosema muayeneleri için kabul edilir:

• Dondurulan her numune, hangi kovandan geldiği anlaşılacak şekilde açık ve kolay okunur biçimde etiketlenmelidir.
• Saklama sıcaklığı: en az −8 °C.
• Arı numuneleri muayeneden önce dondurucuda yaklaşık 3-5 ay saklanabilir.
• Numuneler çözdürülüp yeniden dondurulmamalıdır.

2. Homojenize edin

1. Arı numunesine 25 mL deiyonize su ekleyin (arı başına 1 mL).
2. Arıların tamamını iyice ezin (homojenize edin), böylece düzgün bir bulamaç elde edin.
3. Süspansiyonu iyice karıştırın. Sporlar dibe çökme eğilimindedir.

Neden arıların tamamı homojenize edilir?

Nosema sporları yalnızca sindirim kanalında değil, hipofarenks bezlerinde ve erkek arı spermasında da bulunur. İşçi arıların tamamının homojenize edilmesi, sporların eksiksiz tespit edilmesini sağlar.

Mikroskop preparatının hazırlanması

1. Mikropipetle, iyi karıştırılmış bulamaçtan küçük bir damlayı (yaklaşık 40 µL) temiz bir cam lamın üzerine koyun.
2. Üzerini lamelle kapatın.

Varsa hemositometre kullanın

Hemositometreniz varsa onu kullanın. Sayım daha kolay ve daha standart olur.

Sporların sayılması

1. Mikroskobu ince ayar vidasıyla 400× büyütmede netleyin.
2. Rastgele beş görüş alanı seçin (hemositometre kullanıyorsanız beş büyük ızgara karesi).
3. Bir alanda çok fazla döküntü varsa rastgele başka bir alan seçin.

4. Her görüş alanında Nosema sporlarını arayın.

   Nosema spp. sporları ovaldir, koyu ve belirgin bir kenarları vardır (Şekil 1). Bunları polen taneleriyle karıştırmamaya dikkat edin. Polen taneleri daha büyük ve tam yuvarlaktır.

   
   Şekil 1 Nosema spp. sporlarının mikroskop görüntüsü (400×)

5. Her görüş alanındaki sporları sayın ve değerleri not edin.

6. Apisense uygulamasına yüklemek için beş görüş alanının her birinin fotoğrafını çekin.
7. Beş görüş alanındaki spor sayısının ortalamasını hesaplayın. Ortalama sonucu yorumlamanıza yardım eder. Uygulamaya ortalama değil, her alanın kendi sayısı girilir (bkz. Apisense uygulamasına giriş).

Örnek: Tablo 1

Her numune için beş mikroskop görüş alanında görülen Nosema sporu sayısı.

Numune	Alan 1	Alan 2	Alan 3	Alan 4	Alan 5	Ortalama
1	40	38	52	44	50	44,8
2	…	…	…	…	…	…

Apisense uygulamasına giriş

Sonucu, numunenin alındığı kovana kaydedin.

1. Kovan detayları ekranını açın: Arılıklar sekmesi → arılık kartı → kovan kartı.
2. Alt menüde Ekle öğesini, ardından Muayene seçeneğini seçin.

3. Muayene ekle ekranında şunları doldurun:

   • Muayene tarihi: mikroskopiyi yaptığınız gün.
   • Muayene türü: açılır listeden Mikroskopi seçeneğini seçin.
   • Fotoğraflar ve spor sayıları: her görüş alanı için bir tane olmak üzere 5 fotoğraf ekleyin. Her fotoğrafın altında kendi Nosema spor sayısı (1), (2), … (5) alanı vardır. Buraya o görüş alanında saydığınız spor sayısını girin.

4. Muayeneyi ekranın altındaki onay düğmesiyle (✓ simgesi) kaydedin.

Ortalamayı değil, her alanın sayısını girersiniz

Uygulama beş ayrı sayı alır, her fotoğraf için bir tane. Uygulamaya Tablo 1'deki ortalamayı girmeyin. Ortalama kendi sonucunuzu yorumlamanız içindir, uygulama ise her alanın sayısını alır.

Setin tamamı zorunludur: beş fotoğraf ve beş sayı olmadan uygulama muayeneyi kaydetmez. 5 fotoğraftan N tanesi eksik mesajını gösterir veya boş sayı alanını işaretler.

Kaydedilen muayene, kovan detaylarındaki Muayeneler sekmesinde görünür. Orada muayeneyi açabilir, düzenleyebilir veya silebilirsiniz.

Pilot özelliği

Muayeneler sekmesi ve Ekle menüsündeki Muayene seçeneği yalnızca pilot hesaplarda vardır. Muayene nasıl düzenlenir veya silinir: Kayıt nasıl düzenlenir veya silinir.

Kaynaklar

1. Bartolomé C, Higes M, Hernández RM, Chen YP, Evans JD, Huang Q. The recent revision of the genera Nosema and Vairimorpha (Microsporidia: Nosematidae) was flawed and misleads the bee scientific community. J Invertebr Pathol. 2024;206: 108146. doi:10.1016/j.jip.2024.108146
2. Fries I, Chauzat M-P, Chen Y-P, Doublet V, Genersch E, Gisder S, et al. Standard methods for Nosema research. J Apic Res. 2013;52: 1-28. doi:10.3896/IBRA.1.52.1.14
3. Nosemosis of honey bees, WOAH Terrestrial Manual. 2024. WOAH (PDF)
4. Mazur ED, Gajda AM. Nosemosis in Honeybees: A Review Guide on Biology and Diagnostic Methods. Applied Sciences. 2022;12: 5890. doi:10.3390/app12125890