Mikroskopie Nosema/Vairimorpha

Verfahren zum Nachweis und zur Zählung von Nosema/Vairimorpha-Sporen in einem Bienenvolk.

Videoanleitung

Material

• Lichtmikroskop mit eingebauter Kamera. Erforderliche Ausstattung:

  • Optik: Linsen aus optischem Glas
  • Gesamtvergrößerung: 400× (Objektiv: 40×; Okular: WF10×)
  • Kreuztisch: beweglich nach links und rechts sowie nach vorn und hinten
  • Mindestauflösung der Kamera: 0,3 MP

  Beispiele für Mikroskope, die diese Anforderungen erfüllen:

  • AmScope M150 Series mit USB-Kamera
  • Levenhuk Rainbow D2L 0.3M

• Pinzette

• Mörser und Pistill (oder ein anderes Werkzeug zum Homogenisieren)
• Hämozytometer (Zählkammer, bevorzugt) oder normale Objektträger
• Deckgläser
• Deionisiertes Wasser (bevorzugt) oder Leitungswasser
• Mikropipetten mit Einwegspitzen

Probenvorbereitung

1. Bienenprobe entnehmen

Wählen Sie eine der folgenden Möglichkeiten:

• Tote Bienen: Sammeln Sie 25 tote Arbeiterinnen vom Gitterboden der Beute. Die Bienen müssen tot sein, dürfen aber keine Anzeichen von Verwesung oder Schimmel zeigen.
• Lebende Bienen: Fangen Sie 25 lebende Arbeiterinnen am Flugloch.

Lagerung vor der Untersuchung

Wenn Sie die Untersuchung nicht sofort durchführen oder die Probe nicht sofort verschicken können: Das Einfrieren von Bienen ist nur für Nosema-Untersuchungen zulässig:

• Jede eingefrorene Probe muss deutlich und eindeutig der Beute zugeordnet sein, aus der sie stammt.
• Lagertemperatur: mindestens −8 °C.
• Bienenproben können etwa 3-5 Monate vor der Untersuchung im Gefrierschrank bleiben.
• Proben dürfen nicht aufgetaut und wieder eingefroren werden.

2. Homogenisieren

1. Geben Sie 25 mL deionisiertes Wasser zur Bienenprobe (1 mL pro Biene).
2. Zerdrücken (homogenisieren) Sie die ganzen Bienen gründlich, bis eine gleichmäßige Suspension entsteht.
3. Mischen Sie die Suspension gründlich. Sporen setzen sich gern am Boden ab.

Warum ganze Bienen homogenisieren?

Nosema-Sporen kommen nicht nur im Verdauungstrakt vor, sondern auch in den Futtersaftdrüsen (Hypopharynxdrüsen) und im Sperma der Drohnen. Wenn Sie ganze Arbeiterinnen homogenisieren, erfassen Sie die Sporen vollständig.

Präparat für das Mikroskop vorbereiten

1. Geben Sie mit einer Mikropipette einen kleinen Tropfen (~40 µL) der gut gemischten Suspension auf einen sauberen Objektträger.
2. Decken Sie ihn mit einem Deckglas ab.

Verwenden Sie ein Hämozytometer, wenn vorhanden

Wenn Sie ein Hämozytometer (Zählkammer) haben, verwenden Sie es. Das Zählen ist dann leichter und besser vergleichbar.

Sporen zählen

1. Stellen Sie das Mikroskop bei 400-facher Vergrößerung mit dem Feintrieb scharf.
2. Wählen Sie fünf zufällige Gesichtsfelder (bei einem Hämozytometer fünf große Quadrate des Zählnetzes).
3. Wenn ein Feld zu viele Verunreinigungen enthält, wählen Sie zufällig ein anderes.

4. Suchen Sie in jedem Gesichtsfeld nach Nosema-Sporen.

   Sporen von Nosema spp. sind oval und haben einen dunklen, klar begrenzten Rand (Abb. 1). Verwechseln Sie sie nicht mit Pollenkörnern: Diese sind größer und ganz rund.

   
   Abb. 1 Mikroskopisches Bild (400×) von Sporen von Nosema spp.

5. Zählen Sie die Sporen in jedem Gesichtsfeld und notieren Sie die Werte.

6. Machen Sie von jedem der fünf Gesichtsfelder ein Foto, um es in die Apisense App hochzuladen.
7. Berechnen Sie den Mittelwert der Sporen aus den fünf Gesichtsfeldern. Er hilft Ihnen, das Ergebnis zu beurteilen. In die App tragen Sie die Zahlen der einzelnen Felder ein, nicht den Mittelwert (siehe Eintragen in der Apisense App).

Beispiel: Tabelle 1

Anzahl der Nosema-Sporen in fünf Gesichtsfeldern pro Probe.

Probe	Feld 1	Feld 2	Feld 3	Feld 4	Feld 5	Mittelwert
1	40	38	52	44	50	44,8
2	…	…	…	…	…	…

Eintragen in der Apisense App

Tragen Sie das Ergebnis bei der Beute ein, aus der die Probe stammt.

1. Öffnen Sie Angaben zur Beute: Tab Bienenstände → Kachel des Bienenstands → Kachel der Beute.
2. Wählen Sie im unteren Menü Hinzufügen... und dann Untersuchung.

3. Füllen Sie auf dem Bildschirm Untersuchung hinzufügen aus:

   • Untersuchungsdatum: der Tag, an dem Sie die Mikroskopie durchgeführt haben.
   • Untersuchungstyp: Wählen Sie in der Liste Mikroskopie.
   • Fotos und Sporenzahlen: Fügen Sie 5 Fotos hinzu, eines pro Gesichtsfeld. Nach jedem Foto folgt ein eigenes Feld Anzahl der Nosema-Sporen (1), (2), … (5). Tragen Sie dort die Zahl der Sporen ein, die Sie in genau diesem Gesichtsfeld gezählt haben.

4. Speichern Sie die Untersuchung mit der Bestätigungstaste (Symbol ✓) unten auf dem Bildschirm.

Sie tragen die Zahlen der einzelnen Felder ein, nicht den Mittelwert

Die App nimmt fünf einzelne Zahlen an, eine pro Foto. Tragen Sie nicht den Mittelwert aus Tabelle 1 ein. Der Mittelwert hilft Ihnen, Ihr eigenes Ergebnis zu beurteilen; die App bekommt die einzelnen Zahlen.

Der vollständige Satz ist Pflicht: Ohne fünf Fotos und fünf Zahlen speichert die App die Untersuchung nicht. Sie zeigt Es fehlen N von 5 Fotos oder markiert das leere Zahlenfeld.

Die gespeicherte Untersuchung erscheint im Tab Untersuchungen der Angaben zur Beute. Dort können Sie sie öffnen, bearbeiten oder löschen.

Funktion der Pilotphase

Der Tab Untersuchungen und die Option Untersuchung im Menü Hinzufügen... gibt es nur für Konten der Pilotphase. So bearbeiten oder löschen Sie eine Untersuchung: Einen Eintrag bearbeiten oder löschen.

Literatur

1. Bartolomé C, Higes M, Hernández RM, Chen YP, Evans JD, Huang Q. The recent revision of the genera Nosema and Vairimorpha (Microsporidia: Nosematidae) was flawed and misleads the bee scientific community. J Invertebr Pathol. 2024;206: 108146. doi:10.1016/j.jip.2024.108146
2. Fries I, Chauzat M-P, Chen Y-P, Doublet V, Genersch E, Gisder S, et al. Standard methods for Nosema research. J Apic Res. 2013;52: 1-28. doi:10.3896/IBRA.1.52.1.14
3. Nosemosis of honey bees, WOAH Terrestrial Manual. 2024. WOAH (PDF)
4. Mazur ED, Gajda AM. Nosemosis in Honeybees: A Review Guide on Biology and Diagnostic Methods. Applied Sciences. 2022;12: 5890. doi:10.3390/app12125890