Ga naar inhoud

Microscopie van Nosema/Vairimorpha

Procedure om sporen van Nosema/Vairimorpha in een bijenvolk op te sporen en te tellen.

Videohandleiding

Materiaal

  • Lichtmicroscoop met ingebouwde camera. Vereiste specificaties:

    • Optisch systeem: lenzen van optisch glas
    • Totale vergroting: 400× (objectief: 40×; oculair: WF10×)
    • Kruistafel: links-rechts / voor-achter
    • Minimale resolutie van de camera: 0,3 MP

    Voorbeelden van microscopen die aan deze eisen voldoen:

  • Pincet

  • Vijzel en stamper (of een ander hulpmiddel om te homogeniseren)
  • Hemocytometer (telkamer, bij voorkeur) of gewone objectglaasjes
  • Dekglaasjes
  • Gedemineraliseerd water (bij voorkeur) of kraanwater
  • Micropipetten met wegwerppunten

Het monster voorbereiden

1. Verzamel het bijenmonster

Kies een van deze mogelijkheden:

  • Dode bijen: verzamel 25 dode werksters van de hygiënische bodem van de kast, op voorwaarde dat de bijen dood zijn (geen tekenen van ontbinding of schimmel).
  • Levende bijen: vang 25 levende werksters bij het vlieggat.

Bewaren voor het onderzoek

Als je het onderzoek niet meteen kunt doen of het monster niet meteen kunt versturen, is invriezen van bijen alleen toegestaan voor Nosema-onderzoeken:

  • Elk ingevroren monster moet duidelijk en eenvoudig herkenbaar zijn, zodat je weet uit welke kast het komt.
  • Bewaartemperatuur: ten minste −8 °C.
  • Bijenmonsters kunnen ongeveer 3 tot 5 maanden in de vriezer blijven voor het onderzoek.
  • Monsters mogen niet ontdooid en opnieuw ingevroren worden.

2. Homogeniseer

  1. Voeg 25 mL gedemineraliseerd water toe aan het bijenmonster (1 mL per bij).
  2. Plet (homogeniseer) de hele bijen grondig tot een gelijkmatige brij.
  3. Meng de suspensie goed: sporen zakken graag naar de bodem.

Waarom hele bijen homogeniseren?

Nosema-sporen zitten niet alleen in het spijsverteringskanaal, maar ook in de hypofaryngeale klieren en in het sperma van darren. Als je hele werksters homogeniseert, spoor je de sporen volledig op.

Het preparaat maken

  1. Breng met een micropipet een kleine druppel (~40 µL) van de goed gemengde brij op een schoon objectglaasje.
  2. Dek af met een dekglaasje.

Gebruik een hemocytometer als je die hebt

Als je een hemocytometer hebt, gebruik die dan: tellen is makkelijker en beter gestandaardiseerd.

Sporen tellen

  1. Stel de microscoop scherp bij 400× vergroting met de fijninstelling.
  2. Kies vijf willekeurige gezichtsvelden (vijf grote vakken van het raster als je een hemocytometer gebruikt).
  3. Als een gezichtsveld te veel vuil bevat, kies dan willekeurig een ander.

  4. Zoek in elk gezichtsveld naar Nosema-sporen.

    Sporen van Nosema spp. zijn ovaal, met een donkere, scherp afgetekende rand (Fig. 1). Verwar ze niet met stuifmeelkorrels: die zijn groter en perfect rond.

    Microscopisch beeld (400×) van sporen van Nosema spp.
    Fig. 1 Microscopisch beeld (400×) van sporen van Nosema spp.

  5. Tel het aantal sporen in elk gezichtsveld en noteer de waarden.

  6. Maak een foto van elk van de vijf gezichtsvelden om ze in de Apisense-app te uploaden.
  7. Bereken het gemiddelde aantal sporen van de vijf gezichtsvelden: dat helpt je het resultaat te lezen. In de app voer je de aantallen per gezichtsveld in, niet het gemiddelde (zie Invoeren in de Apisense-app).

Voorbeeld: tabel 1

Aantal Nosema-sporen in vijf microscopische gezichtsvelden per monster.

Monster Veld 1 Veld 2 Veld 3 Veld 4 Veld 5 Gemiddelde
1 40 38 52 44 50 44,8
2 … … … … … …

Invoeren in de Apisense-app

Leg het resultaat vast bij de kast waar het monster vandaan komt.

  1. Open Gegevens kast: het tabblad Bijenstanden → de bijenstandkaart → de kastkaart.
  2. Kies in het onderste menu Toevoegen... en daarna Onderzoek.

  3. Vul op het scherm Onderzoek toevoegen in:

    • Datum onderzoek: de dag waarop je de microscopie hebt gedaan.
    • Soort onderzoek: kies Microscopie in de lijst.
    • Foto's en aantallen sporen: voeg 5 foto's toe, één per gezichtsveld. Na elke foto volgt een eigen veld Aantal nosemasporen (1), (2), … (5): vul het aantal sporen in dat je in dat ene gezichtsveld hebt geteld.

  4. Sla het onderzoek op met de bevestigingsknop (het ✓-pictogram) onder aan het scherm.

Je voert de aantallen per gezichtsveld in, niet het gemiddelde

De app neemt vijf afzonderlijke getallen aan, één per foto. Vul niet het gemiddelde uit tabel 1 in. Het gemiddelde helpt je je eigen resultaat te lezen; de app krijgt de afzonderlijke aantallen.

De volledige set is verplicht: zonder vijf foto's en vijf aantallen slaat de app het onderzoek niet op. De app toont dan Er ontbreken N van 5 foto's of markeert het lege veld voor het aantal.

Het opgeslagen onderzoek verschijnt in het tabblad Onderzoeken van de gegevens van de kast. Daar kun je het openen, bewerken of verwijderen.

Functie voor de pilot

Het tabblad Onderzoeken en de optie Onderzoek in het menu Toevoegen... zijn alleen beschikbaar voor pilotaccounts. Een onderzoek bewerken of verwijderen: Een invoer bewerken of verwijderen.

Literatuur

  1. Bartolomé C, Higes M, Hernández RM, Chen YP, Evans JD, Huang Q. The recent revision of the genera Nosema and Vairimorpha (Microsporidia: Nosematidae) was flawed and misleads the bee scientific community. J Invertebr Pathol. 2024;206: 108146. doi:10.1016/j.jip.2024.108146
  2. Fries I, Chauzat M-P, Chen Y-P, Doublet V, Genersch E, Gisder S, et al. Standard methods for Nosema research. J Apic Res. 2013;52: 1-28. doi:10.3896/IBRA.1.52.1.14
  3. Nosemosis of honey bees, WOAH Terrestrial Manual. 2024. WOAH (PDF)
  4. Mazur ED, Gajda AM. Nosemosis in Honeybees: A Review Guide on Biology and Diagnostic Methods. Applied Sciences. 2022;12: 5890. doi:10.3390/app12125890