Microscopía de Nosema/Vairimorpha

Procedimiento para detectar y cuantificar esporas de Nosema/Vairimorpha en una colonia de abejas.

Vídeo tutorial

Materiales

• Microscopio óptico con cámara integrada. Especificaciones necesarias:

  • Sistema óptico: lentes de vidrio óptico
  • Aumento total: 400× (objetivo: 40×; ocular: WF10×)
  • Platina mecánica: izquierda-derecha / adelante-atrás
  • Resolución mínima de la cámara: 0,3 MP

  Ejemplos de microscopios que cumplen estos requisitos:

  • AmScope M150 Series con cámara USB
  • Levenhuk Rainbow D2L 0.3M

• Pinzas

• Mortero y mano de mortero (u otra herramienta para homogeneizar)
• Hemocitómetro (cámara de recuento, preferible) o portaobjetos normales
• Cubreobjetos
• Agua desionizada (preferible) o agua del grifo
• Micropipetas con puntas desechables

Preparación de la muestra

1. Recoge la muestra de abejas

Usa una de estas opciones:

• Abejas muertas: recoge 25 obreras muertas del fondo higiénico de la colmena, siempre que estén muertas (sin signos de descomposición ni moho).
• Abejas vivas: recoge 25 obreras vivas capturadas en la piquera.

Conservación antes del examen

Si no puedes hacer el examen o enviar la muestra enseguida, congelar las abejas solo se acepta para los exámenes de Nosema:

• Cada muestra congelada debe estar identificada de forma clara y sencilla con la colmena de la que procede.
• Temperatura de conservación: como mínimo −8 °C.
• Las muestras de abejas pueden guardarse en el congelador unos 3-5 meses antes del examen.
• Las muestras no se deben descongelar y volver a congelar.

2. Homogeneiza

1. Añade 25 mL de agua desionizada a la muestra de abejas (1 mL por abeja).
2. Tritura (homogeneiza) bien las abejas enteras hasta obtener una suspensión uniforme.
3. Mezcla bien la suspensión: las esporas tienden a depositarse en el fondo.

¿Por qué homogeneizar abejas enteras?

Las esporas de Nosema no están solo en el tubo digestivo, sino también en las glándulas hipofaríngeas y en el semen de los zánganos. Homogeneizar obreras enteras garantiza una detección completa.

Preparación del portaobjetos

1. Con una micropipeta, pon una gota pequeña (~40 µL) de la suspensión bien mezclada sobre un portaobjetos limpio.
2. Cúbrela con un cubreobjetos.

Usa un hemocitómetro si tienes uno

Si tienes un hemocitómetro (cámara de recuento), úsalo: el recuento es más fácil y más estandarizado.

Recuento de esporas

1. Enfoca el microscopio a 400 aumentos con el tornillo micrométrico.
2. Elige cinco campos de visión al azar (cinco cuadrados grandes de la cuadrícula si usas un hemocitómetro).
3. Si un campo tiene demasiada suciedad, elige otro al azar.

4. Busca esporas de Nosema en cada campo de visión.

   Las esporas de Nosema spp. son ovaladas, con un borde oscuro y bien definido (Fig. 1). Ten cuidado de no confundirlas con granos de polen, que son más grandes y perfectamente redondos.

   
   Fig. 1 Imagen al microscopio (400×) de esporas de Nosema spp.

5. Cuenta las esporas de cada campo de visión y anota los valores.

6. Haz una foto de cada uno de los cinco campos de visión para subirlas a la aplicación Apisense.
7. Calcula la media de esporas de los cinco campos de visión: te ayuda a interpretar el resultado. En la aplicación se introducen los recuentos de cada campo, no la media (consulta Registro en la aplicación Apisense).

Ejemplo: tabla 1

Número de esporas de Nosema observadas en cinco campos de visión al microscopio para cada muestra.

Muestra	Campo 1	Campo 2	Campo 3	Campo 4	Campo 5	Media
1	40	38	52	44	50	44,8
2	…	…	…	…	…	…

Registro en la aplicación Apisense

Registra el resultado en la colmena de la que procede la muestra.

1. Abre Detalles de la colmena: pestaña Apiarios → tarjeta del colmenar → tarjeta de la colmena.
2. En el menú inferior elige Añadir... y luego Examen.

3. En la pantalla Añadir examen rellena:

   • Fecha del examen: el día en que hiciste la microscopía.
   • Tipo de examen: elige Microscopía en la lista desplegable.
   • Fotos y recuentos de esporas: añade 5 fotos, una por campo de visión. Debajo de cada foto hay un campo propio Cantidad de esporas de Nosema (1), (2), … (5): introduce el número de esporas contadas en ese campo de visión concreto.

4. Guarda el examen con el botón de confirmar (el icono ✓) en la parte inferior de la pantalla.

Introduces los recuentos de cada campo, no la media

La aplicación recibe cinco números separados, uno por foto. No introduzcas la media de la tabla 1: la media sirve para que interpretes tu propio resultado, mientras que la aplicación recibe los recuentos individuales.

El conjunto completo es obligatorio: sin cinco fotos y cinco recuentos la aplicación no guarda el examen. Muestra Faltan N de 5 fotos o marca el campo de recuento vacío.

El examen guardado aparece en la pestaña Exámenes de los detalles de la colmena, donde puedes abrirlo, editarlo o eliminarlo.

Función del piloto

La pestaña Exámenes y la opción Examen del menú Añadir... solo están disponibles en las cuentas del piloto. Cómo editar o eliminar un examen: Cómo editar o eliminar una entrada.

Referencias

1. Bartolomé C, Higes M, Hernández RM, Chen YP, Evans JD, Huang Q. The recent revision of the genera Nosema and Vairimorpha (Microsporidia: Nosematidae) was flawed and misleads the bee scientific community. J Invertebr Pathol. 2024;206: 108146. doi:10.1016/j.jip.2024.108146
2. Fries I, Chauzat M-P, Chen Y-P, Doublet V, Genersch E, Gisder S, et al. Standard methods for Nosema research. J Apic Res. 2013;52: 1-28. doi:10.3896/IBRA.1.52.1.14
3. Nosemosis of honey bees, WOAH Terrestrial Manual. 2024. WOAH (PDF)
4. Mazur ED, Gajda AM. Nosemosis in Honeybees: A Review Guide on Biology and Diagnostic Methods. Applied Sciences. 2022;12: 5890. doi:10.3390/app12125890