Microscopia Nosema/Vairimorpha

Procedura per individuare e quantificare le spore di Nosema/Vairimorpha in una famiglia di api.

Video tutorial

Materiali

• Microscopio ottico con fotocamera integrata. Caratteristiche richieste:

  • Sistema ottico: lenti in vetro ottico
  • Ingrandimento totale: 400× (obiettivo: 40×; oculare: WF10×)
  • Tavolino traslatore: sinistra-destra / avanti-indietro
  • Risoluzione minima della fotocamera: 0,3 MP

  Esempi di microscopi che soddisfano questi requisiti:

  • AmScope M150 Series con fotocamera USB
  • Levenhuk Rainbow D2L 0.3M

• Pinzette

• Mortaio e pestello (o un altro strumento per omogeneizzare)
• Emocitometro (camera conta-cellule, preferibile) o normali vetrini portaoggetti
• Vetrini coprioggetto
• Acqua deionizzata (preferibile) o acqua del rubinetto
• Micropipette con puntali monouso

Preparazione del campione

1. Preleva il campione di api

Usa una delle seguenti opzioni:

• Api morte: raccogli 25 api operaie morte dal fondo antivarroa dell'arnia, a condizione che le api siano morte (senza segni di decomposizione o di muffa).
• Api vive: cattura 25 api operaie vive alla porticina di volo dell'arnia.

Conservazione prima dell'esame

Se non puoi eseguire subito l'esame o spedire subito il campione, il congelamento delle api è ammesso solo per gli esami della Nosema:

• Ogni campione congelato deve essere identificato in modo chiaro e semplice con l'arnia da cui proviene.
• Temperatura di conservazione: almeno −8 °C.
• I campioni di api possono restare nel congelatore per circa 3-5 mesi prima dell'esame.
• I campioni non devono essere scongelati e congelati di nuovo.

2. Omogeneizza

1. Aggiungi 25 mL di acqua deionizzata al campione di api (1 mL per ape).
2. Schiaccia (omogeneizza) a fondo le api intere fino a ottenere una sospensione uniforme.
3. Mescola a fondo la sospensione: le spore tendono a depositarsi sul fondo.

Perché omogeneizzare le api intere?

Le spore di Nosema si trovano non solo nel tubo digerente, ma anche nelle ghiandole ipofaringee e nello sperma dei fuchi. Omogeneizzando le operaie intere, il rilevamento è completo.

Preparazione del vetrino

1. Con una micropipetta deponi una piccola goccia (~40 µL) della sospensione ben mescolata su un vetrino pulito.
2. Copri con un vetrino coprioggetto.

Usa un emocitometro, se ce l'hai

Se hai un emocitometro, usalo: il conteggio è più semplice e più standardizzato.

Conteggio delle spore

1. Metti a fuoco il microscopio a 400 ingrandimenti con la vite micrometrica.
2. Scegli cinque campi visivi a caso (cinque quadrati grandi del reticolo, se usi un emocitometro).
3. Se un campo contiene troppi detriti, scegline un altro a caso.

4. Cerca le spore di Nosema in ogni campo visivo.

   Le spore di Nosema spp. sono ovali, con un bordo scuro e ben definito (Fig. 1). Fai attenzione a non confonderle con i granuli di polline, che sono più grandi e perfettamente rotondi.

   
   Fig. 1 Immagine al microscopio (400×) di spore di Nosema spp.

5. Conta le spore in ogni campo visivo e annota i valori.

6. Fai una foto di ciascuno dei cinque campi visivi per caricarle nell'app Apisense.
7. Calcola la media delle spore dei cinque campi visivi: ti aiuta a interpretare il risultato. Nell'app inserisci i conteggi dei singoli campi, non la media (vedi Inserimento nell'app Apisense).

Esempio: Tabella 1

Numero di spore di Nosema osservate in cinque campi visivi al microscopio per ogni campione.

Campione	Campo 1	Campo 2	Campo 3	Campo 4	Campo 5	Media
1	40	38	52	44	50	44,8
2	…	…	…	…	…	…

Inserimento nell'app Apisense

Registra il risultato sull'arnia da cui proviene il campione.

1. Apri Dettagli arnia: la scheda Apiari → il riquadro dell'apiario → il riquadro dell'arnia.
2. Nel menu in basso scegli Aggiungi..., poi Esame.

3. Nella schermata Aggiungi esame compila:

   • Data dell'esame: il giorno in cui hai eseguito la microscopia.
   • Tipo di esame: scegli Microscopia dall'elenco a discesa.
   • Foto e conteggi delle spore: aggiungi 5 foto, una per campo visivo. Ogni foto ha sotto il proprio campo Conteggio spore Nosema (1), (2), … (5): inserisci il numero di spore contate in quel preciso campo visivo.

4. Salva l'esame con il pulsante di conferma (l'icona ✓) in fondo alla schermata.

Inserisci i conteggi dei singoli campi, non la media

L'app accetta cinque numeri separati, uno per foto. Non inserire la media della Tabella 1: la media serve a te per interpretare il tuo risultato, mentre l'app riceve i singoli conteggi.

La serie completa è obbligatoria: senza cinque foto e cinque conteggi l'app non salva l'esame. Mostra Mancano N di 5 foto oppure segnala il campo del conteggio vuoto.

L'esame salvato compare nella scheda Esami dei dettagli dell'arnia, dove puoi aprirlo, modificarlo o eliminarlo.

Funzione del programma pilota

La scheda Esami e l'opzione Esame nel menu Aggiungi... sono disponibili solo per gli account del programma pilota. Come modificare o eliminare un esame: Modificare o eliminare una voce.

Bibliografia

1. Bartolomé C, Higes M, Hernández RM, Chen YP, Evans JD, Huang Q. The recent revision of the genera Nosema and Vairimorpha (Microsporidia: Nosematidae) was flawed and misleads the bee scientific community. J Invertebr Pathol. 2024;206: 108146. doi:10.1016/j.jip.2024.108146
2. Fries I, Chauzat M-P, Chen Y-P, Doublet V, Genersch E, Gisder S, et al. Standard methods for Nosema research. J Apic Res. 2013;52: 1-28. doi:10.3896/IBRA.1.52.1.14
3. Nosemosis of honey bees, WOAH Terrestrial Manual. 2024. WOAH (PDF)
4. Mazur ED, Gajda AM. Nosemosis in Honeybees: A Review Guide on Biology and Diagnostic Methods. Applied Sciences. 2022;12: 5890. doi:10.3390/app12125890