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Microscopie Nosema/Vairimorpha

Procédure de détection et de comptage des spores de Nosema/Vairimorpha dans une colonie d'abeilles.

Tutoriel vidéo

Matériel

  • Microscope optique avec caméra intégrée. Caractéristiques requises :

    • Système optique : lentilles en verre optique
    • Grossissement total : 400× (objectif : 40× ; oculaire : WF10×)
    • Platine mécanique : gauche-droite / avant-arrière
    • Résolution minimale de la caméra : 0,3 MP

    Exemples de microscopes qui répondent à ces exigences :

  • Pince

  • Mortier et pilon (ou un autre outil d'homogénéisation)
  • Hémocytomètre (cellule de comptage, de préférence) ou lames de microscope standard
  • Lamelles
  • Eau déminéralisée (de préférence) ou eau du robinet
  • Micropipettes avec embouts jetables

Préparation de l'échantillon

1. Prélevez l'échantillon d'abeilles

Choisissez une des options suivantes :

  • Abeilles mortes : ramassez 25 ouvrières mortes sur le plancher grillagé de la ruche, à condition qu'elles ne présentent aucun signe de décomposition ni de moisissure.
  • Abeilles vivantes : attrapez 25 ouvrières vivantes à l'entrée de la ruche.

Conservation avant l'examen

Si vous ne pouvez pas réaliser l'examen ou envoyer l'échantillon tout de suite, la congélation des abeilles est acceptée uniquement pour les examens de Nosema :

  • Chaque échantillon congelé doit être identifié clairement et sans ambiguïté, pour que l'on sache de quelle ruche il provient.
  • Température de conservation : au moins −8 °C.
  • Les échantillons d'abeilles peuvent rester au congélateur environ 3 à 5 mois avant l'examen.
  • Les échantillons ne doivent pas être décongelés puis recongelés.

2. Homogénéisez

  1. Ajoutez 25 mL d'eau déminéralisée à l'échantillon d'abeilles (1 mL par abeille).
  2. Écrasez (homogénéisez) soigneusement les abeilles entières pour obtenir une bouillie homogène.
  3. Mélangez bien la suspension : les spores ont tendance à se déposer au fond.

Pourquoi homogénéiser des abeilles entières ?

Les spores de Nosema ne se trouvent pas seulement dans le tube digestif, mais aussi dans les glandes hypopharyngiennes et dans le sperme des faux-bourdons. En homogénéisant des ouvrières entières, vous détectez les spores de façon complète.

Préparation de la lame

  1. Avec une micropipette, déposez une petite goutte (~40 µL) de la suspension bien mélangée sur une lame propre.
  2. Couvrez-la d'une lamelle.

Utilisez un hémocytomètre si vous en avez un

Si vous avez un hémocytomètre (cellule de comptage), utilisez-le : le comptage est plus facile et plus standardisé.

Comptage des spores

  1. Faites la mise au point du microscope au grossissement 400× avec la vis micrométrique.
  2. Choisissez cinq champs de vision au hasard (cinq grands carrés de la grille avec un hémocytomètre).
  3. Si un champ contient trop de débris, choisissez-en un autre au hasard.

  4. Cherchez les spores de Nosema dans chaque champ de vision.

    Les spores de Nosema spp. sont ovales, avec un bord sombre et bien net (Fig. 1). Ne les confondez pas avec les grains de pollen, plus gros et parfaitement ronds.

    Vue au microscope (400×) de spores de Nosema spp.
    Fig. 1 Vue au microscope (400×) de spores de Nosema spp.

  5. Comptez les spores dans chaque champ de vision et notez les valeurs.

  6. Prenez une photo de chacun des cinq champs de vision pour l'envoyer dans l'application Apisense.
  7. Calculez la moyenne des spores des cinq champs de vision : elle vous aide à lire le résultat. Dans l'application, vous saisissez les nombres de chaque champ, pas la moyenne (voir Saisie dans l'application Apisense).

Exemple : tableau 1

Nombre de spores de Nosema observées dans cinq champs de vision au microscope pour chaque échantillon.

Échantillon Champ 1 Champ 2 Champ 3 Champ 4 Champ 5 Moyenne
1 40 38 52 44 50 44,8
2 … … … … … …

Saisie dans l'application Apisense

Enregistrez le résultat dans la ruche d'où vient l'échantillon.

  1. Ouvrez Détails de la ruche : onglet Ruchers → carte du rucher → carte de la ruche.
  2. Dans le menu du bas, choisissez Ajouter..., puis Examen.

  3. Sur l'écran Ajouter un examen, remplissez :

    • Date de l'examen : le jour où vous avez fait la microscopie.
    • Type d'examen : choisissez Microscopie dans la liste.
    • Photos et nombres de spores : ajoutez 5 photos, une par champ de vision. Chaque photo est suivie de son propre champ Nombre de spores de Nosema (1), (2), … (5) : saisissez le nombre de spores comptées dans ce champ de vision précis.

  4. Enregistrez l'examen avec le bouton de confirmation (icône ✓) en bas de l'écran.

Vous saisissez les nombres de chaque champ, pas la moyenne

L'application prend cinq nombres séparés, un par photo. N'y saisissez pas la moyenne du tableau 1 : la moyenne vous aide à lire votre propre résultat, l'application reçoit les nombres de chaque champ.

L'ensemble complet est obligatoire : sans cinq photos et cinq nombres, l'application n'enregistre pas l'examen. Elle affiche Il manque N sur 5 photos ou signale le champ de nombre vide.

L'examen enregistré apparaît dans l'onglet Examens des détails de la ruche, où vous pouvez l'ouvrir, le modifier ou le supprimer.

Fonction pilote

L'onglet Examens et l'option Examen du menu Ajouter... sont disponibles uniquement pour les comptes pilotes. Pour modifier ou supprimer un examen : Modifier ou supprimer une entrée.

Références

  1. Bartolomé C, Higes M, Hernández RM, Chen YP, Evans JD, Huang Q. The recent revision of the genera Nosema and Vairimorpha (Microsporidia: Nosematidae) was flawed and misleads the bee scientific community. J Invertebr Pathol. 2024;206: 108146. doi:10.1016/j.jip.2024.108146
  2. Fries I, Chauzat M-P, Chen Y-P, Doublet V, Genersch E, Gisder S, et al. Standard methods for Nosema research. J Apic Res. 2013;52: 1-28. doi:10.3896/IBRA.1.52.1.14
  3. Nosemosis of honey bees, WOAH Terrestrial Manual. 2024. WOAH (PDF)
  4. Mazur ED, Gajda AM. Nosemosis in Honeybees: A Review Guide on Biology and Diagnostic Methods. Applied Sciences. 2022;12: 5890. doi:10.3390/app12125890