الفحص المجهري للنوزيما/Vairimorpha

إجراء لاكتشاف أبواغ Nosema/Vairimorpha وتقدير كميتها في طائفة نحل العسل.

فيديو تعليمي

المواد

• مجهر ضوئي بكاميرا مدمجة. المواصفات المطلوبة:

  • النظام البصري: عدسات من زجاج بصري
  • التكبير الكلي: 400× (العدسة الشيئية: 40×؛ العدسة العينية: WF10×)
  • منصة ميكانيكية: يمين-يسار / أمام-خلف
  • أدنى دقة للكاميرا: 0.3 MP

  أمثلة على مجاهر تفي بهذه المتطلبات:

  • AmScope M150 Series with USB camera
  • Levenhuk Rainbow D2L 0.3M

• ملقط

• هاون ومدقة (أو أداة أخرى للهرس)
• شريحة عدّ الخلايا (هيموسيتومتر، مفضّلة) أو شرائح مجهرية عادية
• أغطية الشرائح
• ماء منزوع الأيونات (مفضّل) أو ماء الصنبور
• ماصّات دقيقة برؤوس تُستعمل مرة واحدة

تحضير العينة

1. اجمع عينة النحل

استعمل إحدى الطريقتين التاليتين:

• نحل ميت: اجمع 25 شغالة ميتة من القاعدة الصحية للخلية، بشرط أن يكون النحل ميتًا (بلا علامات تحلّل أو نمو فطري).
• نحل حي: اجمع 25 شغالة حية تُلتقط عند مدخل الخلية.

الحفظ قبل الاختبار

إذا لم تستطع إجراء الاختبار أو شحن العينة فورًا، فتجميد النحل مقبول فقط لاختبارات النوزيما:

• يجب أن تكون كل عينة مجمّدة معرّفة بوضوح وسهولة بالخلية التي أُخذت منها.
• درجة حرارة الحفظ: −8 °C على الأقل.
• يمكن حفظ عينات النحل في المجمّد نحو 3-5 أشهر قبل الاختبار.
• لا يجوز إذابة العينات ثم تجميدها مرة أخرى.

2. الهرس

1. أضف 25 mL من الماء منزوع الأيونات إلى عينة النحل (1 mL لكل نحلة).
2. اهرس النحل كاملًا جيدًا حتى تحصل على معلّق متجانس.
3. اخلط المعلّق جيدًا، فالأبواغ تميل إلى الترسّب في القاع.

لماذا نهرس النحل كاملًا؟

لا توجد أبواغ Nosema في القناة الهضمية فقط، بل أيضًا في الغدد تحت البلعومية وفي سائل ذكور النحل المنوي. هرس الشغالات كاملةً يضمن اكتشافًا شاملًا.

تحضير الشريحة المجهرية

1. بالماصّة الدقيقة، ضع قطرة صغيرة (نحو 40 µL) من المعلّق المخلوط جيدًا على شريحة زجاجية نظيفة.
2. غطّها بغطاء الشريحة.

استعمل شريحة عدّ الخلايا إن توفرت

إذا توفرت شريحة عدّ الخلايا (هيموسيتومتر)، فاستعملها: العدّ أسهل وأكثر توحيدًا.

عدّ الأبواغ

1. اضبط بؤرة المجهر على تكبير 400× بمقبض الضبط الدقيق.
2. اختر خمسة حقول رؤية عشوائية (خمسة مربعات كبيرة من الشبكة إذا كنت تستعمل شريحة عدّ الخلايا).
3. إذا كان في حقل ما كثير من الشوائب، فاختر حقلًا آخر عشوائيًا.

4. ابحث عن أبواغ Nosema في كل حقل رؤية.

   أبواغ Nosema spp. بيضوية، ولها حافة داكنة واضحة (Fig. 1). انتبه ألا تخلط بينها وبين حبوب اللقاح، فهي أكبر ومستديرة تمامًا.

   
   Fig. 1 منظر مجهري (400×) لأبواغ Nosema spp.

5. عُدّ الأبواغ في كل حقل رؤية وسجّل القيم.

6. التقط صورة لكل حقل من حقول الرؤية الخمسة لرفعها إلى تطبيق Apisense.
7. احسب متوسط عدد الأبواغ في حقول الرؤية الخمسة: يساعدك على قراءة النتيجة. ما تُدخله في التطبيق هو عدد كل حقل على حدة، لا المتوسط (انظر الإدخال في تطبيق Apisense).

مثال: الجدول 1

عدد أبواغ Nosema المرصودة في خمسة حقول رؤية مجهرية لكل عينة.

العينة	الحقل 1	الحقل 2	الحقل 3	الحقل 4	الحقل 5	المتوسط
1	40	38	52	44	50	44.8
2	…	…	…	…	…	…

الإدخال في تطبيق Apisense

سجّل النتيجة في الخلية التي أُخذت منها العينة.

1. افتح تفاصيل الخلية: تبويب المناحل ← بطاقة المنحل ← بطاقة الخلية.
2. في القائمة السفلية اختر إضافة...، ثم اختبار.

3. في شاشة إضافة اختبار املأ:

   • تاريخ الاختبار: اليوم الذي أجريت فيه الفحص المجهري.
   • نوع الاختبار: اختر الفحص المجهري من القائمة المنسدلة.
   • الصور وأعداد الأبواغ: أضف 5 صور، صورة لكل حقل رؤية. بعد كل صورة يظهر حقلها الخاص عدد أبواغ النوزيما (1)، (2)، … (5): أدخل عدد الأبواغ التي عددتها في حقل الرؤية هذا تحديدًا.

4. احفظ الاختبار بزر التأكيد (أيقونة ✓) في أسفل الشاشة.

أدخل عدد كل حقل على حدة، لا المتوسط

يأخذ التطبيق خمسة أعداد منفصلة، عددًا لكل صورة. لا تُدخل فيه المتوسط من الجدول 1؛ المتوسط موجود ليساعدك على قراءة نتيجتك، أما التطبيق فيستقبل الأعداد المنفصلة.

المجموعة الكاملة مطلوبة: بدون خمس صور وخمسة أعداد لا يحفظ التطبيق الاختبار، بل يُظهر ينقص N من أصل 5 صور أو يشير إلى حقل العدد الفارغ.

يظهر الاختبار المحفوظ في تبويب الاختبارات في تفاصيل الخلية، حيث يمكنك فتحه أو تعديله أو حذفه.

ميزة البرنامج التجريبي

تبويب الاختبارات وخيار اختبار في قائمة إضافة... متاحان لحسابات البرنامج التجريبي فقط. كيف تعدّل اختبارًا أو تحذفه: كيف تعدّل إدخالًا أو تحذفه.

المراجع

1. Bartolomé C, Higes M, Hernández RM, Chen YP, Evans JD, Huang Q. The recent revision of the genera Nosema and Vairimorpha (Microsporidia: Nosematidae) was flawed and misleads the bee scientific community. J Invertebr Pathol. 2024;206: 108146. doi:10.1016/j.jip.2024.108146
2. Fries I, Chauzat M-P, Chen Y-P, Doublet V, Genersch E, Gisder S, et al. Standard methods for Nosema research. J Apic Res. 2013;52: 1-28. doi:10.3896/IBRA.1.52.1.14
3. Nosemosis of honey bees, WOAH Terrestrial Manual. 2024. WOAH (PDF)
4. Mazur ED, Gajda AM. Nosemosis in Honeybees: A Review Guide on Biology and Diagnostic Methods. Applied Sciences. 2022;12: 5890. doi:10.3390/app12125890