Gå til innhold

Mikroskopi av Nosema/Vairimorpha

Prosedyre for påvisning og telling av Nosema/Vairimorpha-sporer i et bifolk.

Videoveiledning

Materiell

  • Lysmikroskop med innebygd kamera. Påkrevd spesifikasjon:

    • Optikk: linser av optisk glass
    • Total forstørrelse: 400× (objektiv: 40×; okular: WF10×)
    • Kryssbord: venstre-høyre / forover-bakover
    • Minste kameraoppløsning: 0,3 MP

    Eksempler på mikroskoper som oppfyller disse kravene:

  • Pinsett

  • Morter og støter (eller et annet verktøy til homogenisering)
  • Hemocytometer (tellekammer, foretrukket) eller vanlige objektglass
  • Dekkglass
  • Avionisert vann (foretrukket) eller springvann
  • Mikropipetter med engangsspisser

Forberedelse av prøven

1. Samle bieprøven

Bruk ett av disse alternativene:

  • Døde bier: samle 25 døde arbeidsbier fra det hygieniske bunnbrettet i kuben, forutsatt at biene er døde (ingen tegn på forråtnelse eller mugg).
  • Levende bier: samle 25 levende arbeidsbier som du fanger ved flyåpningen.

Oppbevaring før undersøkelsen

Hvis du ikke kan utføre undersøkelsen eller sende prøven med en gang, godtas frysing av bier bare for Nosema-undersøkelser:

  • Hver frossen prøve må være tydelig og enkelt merket med kuben den kommer fra.
  • Oppbevaringstemperatur: minst −8 °C.
  • Bieprøver kan oppbevares i fryseren i omtrent 3-5 måneder før undersøkelsen.
  • Prøvene må ikke tines og fryses på nytt.

2. Homogeniser

  1. Tilsett 25 mL avionisert vann til bieprøven (1 mL per bie).
  2. Knus (homogeniser) hele biene grundig til en jevn masse.
  3. Bland suspensjonen grundig, for sporene har en tendens til å synke til bunns.

Hvorfor homogenisere hele bier?

Nosema-sporer finnes ikke bare i fordøyelseskanalen, men også i fôrsaftkjertlene (hypofarynkskjertlene) og i dronesæd. Når du homogeniserer hele arbeidsbier, sikrer du en fullstendig påvisning.

Forberedelse av mikroskoppreparatet

  1. Bruk en mikropipette og legg en liten dråpe (~40 µL) av den godt blandede massen på et rent objektglass.
  2. Dekk med et dekkglass.

Bruk et hemocytometer hvis du har et

Hvis du har et hemocytometer, bruk det. Tellingen blir enklere og mer standardisert.

Telling av sporer

  1. Still inn skarpheten i mikroskopet ved 400× forstørrelse med finjusteringsskruen.
  2. Velg fem tilfeldige synsfelt (fem store ruter i rutenettet hvis du bruker et hemocytometer).
  3. Hvis et synsfelt inneholder for mye urenheter, velg et annet tilfeldig.

  4. Let etter Nosema-sporer i hvert synsfelt.

    Sporer av Nosema spp. er ovale og har en mørk, tydelig avgrenset kant (Fig. 1). Pass på at du ikke forveksler dem med pollenkorn, som er større og helt runde.

    Mikroskopisk bilde (400×) av sporer av Nosema spp.
    Fig. 1 Mikroskopisk bilde (400×) av sporer av Nosema spp.

  5. Tell antall sporer i hvert synsfelt og noter verdiene.

  6. Ta et bilde av hvert av de fem synsfeltene for å laste dem opp i Apisense-appen.
  7. Regn ut gjennomsnittlig antall sporer fra de fem synsfeltene. Det hjelper deg å tolke resultatet. I appen legger du inn tallene for de enkelte synsfeltene, ikke gjennomsnittet (se Rapportering i Apisense-appen).

Eksempel: tabell 1

Antall Nosema-sporer observert i fem synsfelt i mikroskopet for hver prøve.

Prøve Felt 1 Felt 2 Felt 3 Felt 4 Felt 5 Gjennomsnitt
1 40 38 52 44 50 44,8
2 … … … … … …

Rapportering i Apisense-appen

Registrer resultatet på kuben som prøven kommer fra.

  1. Åpne Bikubedetaljer: fanen Bigårder → kortet for bigården → kortet for kuben.
  2. Velg Legg til... i menyen nederst, og deretter Undersøkelse.

  3. Fyll ut dette på skjermen Legg til undersøkelse:

    • Undersøkelsesdato: dagen du utførte mikroskopien.
    • Undersøkelsestype: velg Mikroskopi i nedtrekkslisten.
    • Bilder og antall sporer: legg til 5 bilder, ett per synsfelt. Etter hvert bilde kommer et eget felt Antall Nosema-sporer (1), (2), … (5). Skriv inn antallet sporer du har talt i akkurat det synsfeltet.

  4. Lagre undersøkelsen med bekreftelsesknappen (ikonet ✓) nederst på skjermen.

Du legger inn tallene for de enkelte synsfeltene, ikke gjennomsnittet

Appen tar imot fem separate tall, ett per bilde. Ikke legg inn gjennomsnittet fra tabell 1. Gjennomsnittet hjelper deg å tolke ditt eget resultat, mens appen får de enkelte tallene.

Hele settet er påkrevd: uten fem bilder og fem tall lagrer ikke appen undersøkelsen. Den viser Mangler N av 5 bilder eller markerer det tomme tallfeltet.

Den lagrede undersøkelsen vises i fanen Undersøkelser i bikubedetaljene. Der kan du åpne, redigere eller slette den.

Pilotfunksjon

Fanen Undersøkelser og valget Undersøkelse i menyen Legg til... er bare tilgjengelige for pilotkontoer. Slik redigerer eller sletter du en undersøkelse: Slik redigerer eller sletter du en oppføring.

Litteratur

  1. Bartolomé C, Higes M, Hernández RM, Chen YP, Evans JD, Huang Q. The recent revision of the genera Nosema and Vairimorpha (Microsporidia: Nosematidae) was flawed and misleads the bee scientific community. J Invertebr Pathol. 2024;206: 108146. doi:10.1016/j.jip.2024.108146
  2. Fries I, Chauzat M-P, Chen Y-P, Doublet V, Genersch E, Gisder S, et al. Standard methods for Nosema research. J Apic Res. 2013;52: 1-28. doi:10.3896/IBRA.1.52.1.14
  3. Nosemosis of honey bees, WOAH Terrestrial Manual. 2024. WOAH (PDF)
  4. Mazur ED, Gajda AM. Nosemosis in Honeybees: A Review Guide on Biology and Diagnostic Methods. Applied Sciences. 2022;12: 5890. doi:10.3390/app12125890