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Microscopia de Nosema/Vairimorpha

Procedimento para detetar e quantificar os esporos de Nosema/Vairimorpha numa colónia de abelhas.

Vídeo tutorial

Material

  • Microscópio ótico com câmara integrada. Especificações exigidas:

    • Sistema ótico: lentes de vidro ótico
    • Ampliação total: 400× (objetiva: 40×; ocular: WF10×)
    • Platina mecânica: esquerda-direita / frente-trás
    • Resolução mínima da câmara: 0,3 MP

    Exemplos de microscópios que cumprem estes requisitos:

  • Pinça

  • Almofariz e pilão (ou outro instrumento para homogeneizar)
  • Hemocitómetro (preferível) ou lâminas de microscópio comuns
  • Lamelas
  • Água desionizada (preferível) ou água da torneira
  • Micropipetas com pontas descartáveis

Preparação da amostra

1. Recolha a amostra de abelhas

Use uma das seguintes opções:

  • Abelhas mortas: recolha 25 obreiras mortas do estrado sanitário da colmeia, desde que as abelhas estejam mortas (sem sinais de decomposição nem de bolor).
  • Abelhas vivas: apanhe 25 obreiras vivas no alvado da colmeia.

Conservação antes da análise

Se não puder fazer a análise ou enviar a amostra de imediato, a congelação das abelhas só é aceite para as análises de Nosema:

  • Cada amostra congelada tem de estar identificada de forma clara e simples com a colmeia de onde vem.
  • Temperatura de conservação: pelo menos −8 °C.
  • As amostras de abelhas podem ficar no congelador cerca de 3 a 5 meses antes da análise.
  • As amostras não podem ser descongeladas e voltar a ser congeladas.

2. Homogeneíze

  1. Junte 25 mL de água desionizada à amostra de abelhas (1 mL por abelha).
  2. Esmague (homogeneíze) bem as abelhas inteiras até obter uma suspensão uniforme.
  3. Misture bem a suspensão: os esporos tendem a depositar-se no fundo.

Porquê homogeneizar abelhas inteiras?

Os esporos de Nosema não estão só no tubo digestivo, mas também nas glândulas hipofaríngeas e no sémen dos zângãos. Ao homogeneizar obreiras inteiras, a deteção é completa.

Preparação da lâmina

  1. Com uma micropipeta, coloque uma pequena gota (~40 µL) da suspensão bem misturada numa lâmina de vidro limpa.
  2. Cubra com uma lamela.

Use um hemocitómetro, se tiver

Se tiver um hemocitómetro, use-o: a contagem é mais fácil e mais padronizada.

Contagem dos esporos

  1. Foque o microscópio com ampliação de 400× com o parafuso micrométrico.
  2. Escolha cinco campos de visão ao acaso (cinco quadrados grandes da grelha, se usar um hemocitómetro).
  3. Se um campo tiver demasiados detritos, escolha outro ao acaso.

  4. Procure os esporos de Nosema em cada campo de visão.

    Os esporos de Nosema spp. são ovais, com um contorno escuro e bem definido (Fig. 1). Tenha cuidado para não os confundir com grãos de pólen, que são maiores e perfeitamente redondos.

    Imagem ao microscópio (400×) de esporos de Nosema spp.
    Fig. 1 Imagem ao microscópio (400×) de esporos de Nosema spp.

  5. Conte os esporos em cada campo de visão e anote os valores.

  6. Tire uma fotografia de cada um dos cinco campos de visão para as carregar na aplicação Apisense.
  7. Calcule a média dos esporos dos cinco campos de visão: ajuda-o a interpretar o resultado. Na aplicação introduz as contagens de cada campo, não a média (ver Registo na aplicação Apisense).

Exemplo: Tabela 1

Número de esporos de Nosema observados em cinco campos de visão ao microscópio, para cada amostra.

Amostra Campo 1 Campo 2 Campo 3 Campo 4 Campo 5 Média
1 40 38 52 44 50 44,8
2 … … … … … …

Registo na aplicação Apisense

Registe o resultado na colmeia de onde vem a amostra.

  1. Abra Detalhes da colmeia: o separador Apiários → o cartão do apiário → o cartão da colmeia.
  2. No menu inferior, escolha Adicionar... e depois Análise.

  3. No ecrã Adicionar análise, preencha:

    • Data da análise: o dia em que fez a microscopia.
    • Tipo de análise: escolha Microscopia na lista pendente.
    • Fotografias e contagens de esporos: adicione 5 fotografias, uma por campo de visão. Por baixo de cada fotografia está o seu próprio campo Número de esporos de nosema (1), (2), … (5): introduza o número de esporos contados nesse campo de visão.

  4. Guarde a análise com o botão de confirmação (o ícone ✓) no fundo do ecrã.

Introduza as contagens de cada campo, não a média

A aplicação recebe cinco números separados, um por fotografia. Não introduza a média da Tabela 1: a média serve para interpretar o seu próprio resultado, enquanto a aplicação recebe as contagens individuais.

O conjunto completo é obrigatório: sem cinco fotografias e cinco contagens, a aplicação não guarda a análise. Mostra Faltam N de 5 fotografias ou assinala o campo de contagem vazio.

A análise guardada aparece no separador Análises dos detalhes da colmeia, onde a pode abrir, editar ou eliminar.

Funcionalidade do programa piloto

O separador Análises e a opção Análise no menu Adicionar... estão disponíveis apenas para contas do programa piloto. Como editar ou eliminar uma análise: Editar ou eliminar um registo.

Bibliografia

  1. Bartolomé C, Higes M, Hernández RM, Chen YP, Evans JD, Huang Q. The recent revision of the genera Nosema and Vairimorpha (Microsporidia: Nosematidae) was flawed and misleads the bee scientific community. J Invertebr Pathol. 2024;206: 108146. doi:10.1016/j.jip.2024.108146
  2. Fries I, Chauzat M-P, Chen Y-P, Doublet V, Genersch E, Gisder S, et al. Standard methods for Nosema research. J Apic Res. 2013;52: 1-28. doi:10.3896/IBRA.1.52.1.14
  3. Nosemosis of honey bees, WOAH Terrestrial Manual. 2024. WOAH (PDF)
  4. Mazur ED, Gajda AM. Nosemosis in Honeybees: A Review Guide on Biology and Diagnostic Methods. Applied Sciences. 2022;12: 5890. doi:10.3390/app12125890